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DFG-Projekt 1962/2-1 Dysregulation der Barrierefunktion von Darmepithel und Gefäßendothel bei Sepsis

Projektteam

• Priv.-Doz. Dr. med. Nicolas Schlegel (Projektleiter)

• Dr. med. Martin Schick (Anästhesie)

• Dr. med. Sven Flemming

• Dr. med. Michael Meir

• Alexia Witchen (MTA)

• Veronika Heimbach (MTA)

Klinisches Problem: Inflammation und Sepsis

Entsprechend der aktuellen Leitlinie definiert sich das Krankheitsbild Sepsis aus einer Kombination verschiedener Parameter bei der die Einschränkung von Organfunktion, Hämodynamik, Vitalfunktionen und laborchemischen Parametern eine wichtige Rolle spielen. Der Ursprung einer Sepsis geht meist von einem septischen Herd aus, der zu einer systemischen Entzündungsreaktion (=systemic inflammatory response syndrome = SIRS) mit Einschränkung von Organfunktionen führt. Auch wenn die chirurgische Sanierung des septischen Herdes gelingt und eine adäquate intensivmedizinische Versorgung erfolgt, ist die Sepsismortalität trotz aller therapeutischen Fortschritte der letzten Jahre unverändert hoch.

Dies ist bedingt durch ein Multiorganversagen, welches wesentlich durch den Zusammenbruch sogenannter biologischer Barrieren mitverursacht wird. Die Aufrechterhaltung dieser Barrieren ist lebenswichtig und kann bei akuten und chronischen Entzündungsreaktionen massiv gestört sein. Die Integrität des Darmepithels und des Blutgefäß-Endothels spielen bei der Sepsis Schlüsselrollen. Spezifische therapeutische Ansätze, um diese Barrieren effektiv zu stabilisieren, existieren bisher nicht.

 

Forschungsansatz: Stabilisierung der Barrierefunktion von Darmepithel und Gefäßendothel bei Sepsis

Von besonderem Interesse sind für uns die Mechanismen und Signalwege, die zur Störung der Integrität der Darmbarriere und der Endothelbarriere bei Entzündungen führen. In diesem Projekt werden die den Entzündungsreaktionen zugrunde liegenden Signalwege die zu Barriereveränderungen im Darmepithel bzw. im Gefäßendothel führen auf zellbiologischer Ebene näher charakterisiert. Hierzu werden biochemische und physiologische Untersuchungen zu Permeabilitätsveränderungen an Zellkulturmodellen der Darm- und Endothelbarriere durchgeführt. Schwerpunkt bilden Untersuchungen zu Rho-GTPasen, da unter anderem unsere Voruntersuchungen gezeigt haben, dass diese z.T. durch Regulation der zytoskelettalen Dynamik Adherens- und Occludenskontakte beeinflussen und damit wesentlich an der Regulation der Darm- und Endothelbarriere beteiligt sind. Die gewonnen Erkenntnisse werden anschließend auf ihre mögliche klinische Relevanz in einem von uns etablierten in vivo-Sepsis-Modell getestet.

Ziel dieser Untersuchungen ist es, durch die mögliche spezifische therapeutische Beeinflussung von Darm- und Endothelbarriere bei Sepsis die Grundlagen für neue Therapieansätze herauszuarbeiten, mit denen Organversagen verhindert und Sepsismortalität gesenkt werden können.

 

Ergebnisse

- Endothelbarriere

Wir haben Daten aus der Literatur bestätigt, dass sowohl bakterielle Zellwandbestandteile wie Lipopolysaccharide (LPS), die typischerweise bei gram-negativer Sepsis im Blut vorhanden sind, als auch proinflammatorische Zytokine wie Tumor necrosis factor-α (TNF-α) zum Zusammenbruch der Endothelbarriere durch eine interendotheliale Lückenbildung führen. Dabei haben wir erstmals gezeigt, dass ein Zusammenbruch der Endothelbarriere durch LPS kausal durch einen Abfall des intrazellulären Botenstoffes cAMP in Endothelzellen bewirkt wird. Für TNF-α haben wir in vitro und in vivo gezeigt, dass die RhoA-Aktivierung und Aktivierung der Rho-Kinase nicht der Mechanismus ist, über den TNF-α den Zusammenbruch der Endothelbarriere induziert. Vielmehr konnten wir beweisen, dass auch TNF-α über den Abfall intraendothelialer cAMP Spiegel mit nachfolgender Inaktivierung von Rac1 den Zusammenbruch der Endothelbarriere verursacht. Um diese Erkenntnisse in therapeutische pharmakologische Ansätze zur Verbesserung der endothelialen Barrierefunktion und der Mikrozirkulation umsetzen zu können, haben wir ein in vivo-Sepsis-Modell bzw. SIRS-Modell an adulten Ratten etabliert. Derzeit arbeiten wir an verschiedenen Ansätzen die Endothelbarriere in diesem in vivo Modell pharmalokologisch effektiv zu stabilisieren.

Die Abbildung zeigt Immunfärbungen gegen die interzellulären Kontaktproteine VE-cadherin, Claudin 5 und F-Actin an kultivierten Endothelzellen. Während man unter Kontrollbedingungen leicht eine regelmäßige Anordnung der interzellulären Zellkontaktproteine erkennen kann, sieht man wie sich nach Applikation des bakteriellen Endotoxins LPS, einem potenten Sepsisinduktor Lücken zwischen den Endothelzellen bilden. Dies geht einher mit einer Fragmentierung von VE-cadherin und einem nahezu volltändigen Verschwinden des Occludenskontaktproteins Claudin5. Diese Vorgänge führen bei der Sepsis zum „Capillary leak“ (= Zusammenbruch der Endothelbarriere) dessen therapeutische Stabilisierung ein Ziel der Forschungsarbeiten unseres Projekts ist.

 

- Darmbarriere

Als in vitro-Modell zur Untersuchung der Darmbarriere verwenden wir die Caco2-Zelllinie. Diese Zellen wurden aus einem menschlichen Adenokarzinom gewonnen und zeigen die Eigenschaft, dass sie sich abhängig von Zellkulturbedingungen sowohl morphologisch als auch funktionell zu Enterozyten differenzieren können. In diesem Modell haben wir die bis zuletzt ungeklärte Rolle der Desmoglein2 (Dsg2)-vermittelten Adhäsion für die Aufrechterhaltung der intestinalen epithelialen Barriere untersucht. Hierbei konnten wir erstmals zeigen, dass die Dsg2-vermittelte Adhäsion für die Integrität der Darmbarriere von großer Bedeutung ist. Interessanterweise haben wir dabei festgestellt, dass die Störung der desmosomalen Adhäsion mittels gegen die Extrazellulärdomäne von Dsg2 gerichteter Antikörper zu einem Verlust der Occludensjunktionen von den Zellgrenzen führt. In unserem in vitro-System haben wir die Rolle der RhoGTPasen für die Regulation der Darmbarriere untersucht. Wir haben gezeigt, dass sowohl die Aktivierung als auch die Inaktivierung von RhoA zu einem Zusammenbruch der Darmbarriere führt. Dagegen führte die gezielte Aktivierung von Rac1 und Cdc42 zu einer Stabilisierung der Darmbarriere. Wir untersuchen derzeit verschiedene Signalwege, die in der Darmbarriere zu Permeabilitätsveränderungen bei Entzüdungen führen. Funktionelle Untersuchungen erfolgen an unserem in vivo-Sepsis-Modell

 

Kooperationspartner

• Prof. Dr. Ana-Maria Waaga-Gasser (Molekulare Onkoimmunologie; Chirurgie I; Universität Würzburg)

• Prof. Dr. med. Christian Wunder (Klinik und Poliklinik für Anästhesie; Universität Würzburg)

• Prof. Dr. med. Jens Waschke (Institut für Anatomie und Zellbiologie; Universität München)

• Prof. Dr. Dr. Bhanu Sinha (Institut für Hygiene und Mikrobiologie; Universität Würzburg)

• Priv.-Doz. Dr. R. Muellenbach (Klinik und Poliklinik für Anästhesie; Universität Würzburg)

 

Forschungsförderung

- DFG Projekt SCHL 1962/2-1 Dysregulation der Barrierefunktion von Darmepithel und Gefäßendothel bei Sepsis

- IZKF Projekt A 102 „Pathophysiologie der Darmbarriere bei akuten Entzündungsreaktionen“ (2009-2012)

- IZKF Projekt Z3/2 „Dysregulation der Endothelbarriere bei Sepsis (2006-2009)

 

Publikationen

Schlegel N, Meir M, Spindler V, Germer CT, Waschke J (2011) Differential role of Rho GTPases in intestinal epithelial barrier regulation in vitro.

J Cell Physiol. 2011 May;226(5):1196-203

 

Schlegel N, Meir M, Heupel WM, Holthöfer B, Leube R, Waschke J (2010) Desmoglein 2-mediated adhesion is required for intestinal epithelial barrier integrity.

Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010 May;298(5):G774-83.

 

Schick MA, Isbary JT, Schlegel N, Brugger J, Waschke J, Roewer N, Wunder C (2010) The impact of crystalloid and colloid infusion on the kidney in rodent sepsis.

Intensive Care Med. 2010 Mar;36(3):541-8

 

Schlegel N, Waschke J (2009) Impaired cAMP and Rac 1 signalling contribute to TNF-alpha-induced endothelial barrier breakdown in microvascular endothelium

Microcirculation. 2009 Aug;16(6):521-33

 

Schlegel N, Waschke J (2009)

Impaired integrin-mediated adhesion contributes to reduced barrier properties in VASP-deficient microvascular endothelium

J Cell Physiol 220(2): 357-366.

Schlegel N, Baumer Y, Drenckhahn D, Waschke J (2009)

LPS-induced endothelial barrier breakdown is cAMP-dependent in vivo and in vitro

Critical Care Medicine; Volume 37(5). 2009.1735-1743

Schlegel N, Waschke J (2009)

VASP is involved in cAMP-mediated Rac 1 activation in microvascular endothelial cells

AJP Cell Physiology; 2009; 296(3):C453-62

Schlegel N, Burger S, Golenhofen N, Walter U, Drenckhahn D, Waschke J (2008)

The role of VASP in regulation of cAMP- and Rac 1-mediated endothelial barrier stabilization

AJP Cell Physiology 2008; 294;178- 188

 

Kooperationsarbeiten

Kredel M, Muellenbach R, Schlegel N, Wunder C, Klingelhöfer, Lange, Roewer, Waschke J, Brederlau J (2010) Pulmonary effects of positive end-expiratory pressure and fluid therapy in experimental lung injury. Exp Lung Res. 2011 Feb;37(1):35-43

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